Le SMLM résolu temporellement (avec un grand décalage PAR) a permis la visualisation de la formation et de la migration dynamiques de clusters HA dans une cellule vivante

Jul 23, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12561 (2023) Citer cet article

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Les propriétés clignotantes d’une seule molécule sont essentielles pour la microscopie de localisation d’une seule molécule (SMLM). En règle générale, les techniques SMLM impliquent l'enregistrement de plusieurs images de points lumineux de molécules uniques, limités par la diffraction, avec un temps d'exposition du détecteur proche de la période de clignotement. Cela fixe une limite à la résolution temporelle du SMLM à quelques dizaines de millisecondes. Conscients qu'une fraction substantielle de molécules uniques émettent des photons sur des échelles de temps beaucoup plus courtes que la période de clignotement moyenne, nous proposons d'accélérer la collecte de données pour capturer ces émetteurs rapides. Nous proposons ici une méthode SMLM (shortSMLM) basée sur une exposition courte et alimentée par un détecteur sCMOS pour comprendre les événements dynamiques (à la fois au niveau d'une molécule unique et d'un ensemble). La technique est démontrée sur un modèle de maladie grippale A, dans lequel des cellules NIH3T3 (cellules fixes et vivantes) ont été transfectées par l'ADN plasmidique Dendra2-HA. L'analyse montre une amélioration de 2,76 fois de la résolution temporelle qui s'accompagne d'un sacrifice de la résolution spatiale et d'un changement de résolution des particules PAR-shift (en termes de précision de localisation) de \(\sim\) 11,82 nm par rapport au SMLM standard. Nous avons visualisé la formation dynamique de clusters HA dans les cellules transfectées après 24 h de transfection d'ADN. Il est à noter qu'une réduction de la résolution spatiale ne modifie pas substantiellement les caractéristiques des clusters (densité des clusters, \(\#\) molécules/cluster, propagation des clusters, etc.) et préserve en fait les caractéristiques critiques. De plus, l’imagerie time-lapse révèle la formation dynamique et la migration d’amas d’hémagglutinine (HA) dans une cellule vivante. Cela suggère que \(short-SMLM\) utilisant un détecteur sCMOS synchronisé à QE élevé (fonctionnant avec des temps d'exposition courts) est excellent pour étudier la dynamique temporelle dans le système cellulaire.

Les techniques standard de microscopie de localisation de molécule unique (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 et variantes13,14,15,16,17) acquièrent généralement plusieurs milliers (\(> 10^{3}\) ) images de molécules uniques pour reconstruire une seule image super-résolue. Cela représente un temps d'acquisition considérable par rapport aux temps d'exposition et de lecture habituels de l'appareil photo. Afin d'accélérer la résolution temporelle globale, l'acquisition des données doit être accélérée. Cependant, il existe une limite à la résolution temporelle en raison du temps de cycle de fluorescence d'une molécule18. Ces derniers temps, peu d’études ont été réalisées utilisant des molécules à clignotement rapide, une intensité d’excitation élevée, des états sombres et une caméra sCMOS19,20,21,22,23. Dans d’autres études, la réduction du temps d’acquisition à l’aide de techniques informatiques s’est révélée prometteuse. D'autres techniques, notamment l'utilisation de moteurs de calcul rapides (FPGA-GPU et CUDA) couplées à l'intelligence artificielle, ont montré un grand potentiel dans SMLM24,25,26,27. Bien que ces techniques soient utiles, elles sont sujettes au photoblanchiment. Ici, nous discutons de l’acquisition rapide de données optimisée par la technologie sCMOS avancée pour capturer des protéines fluorescentes à clignotement rapide (Dendra2). Le comportement clignotant de Dendra2 ainsi que les temps ON/OFF sont étudiés en détail par Avilov et al28. On s’attend à ce que les techniques d’acquisition rapide et les moteurs de calcul rapides constituent une combinaison formidable et soient plus susceptibles de permettre une imagerie super-résolution en temps réel.

Les dernières années ont vu des progrès substantiels dans cette direction et de nombreux groupes de recherche se sont penchés sur cette question. Une approche distincte consiste à augmenter le nombre de molécules uniques actives par image sans modifier l'intensité ni d'autres paramètres expérimentaux . Cependant, cette technique a un coût : une activation importante pourrait entraîner un chevauchement des signatures limitées par la diffraction de molécules uniques, ce qui rendrait impossible la distinction des molécules individuelles et augmenterait par la suite la complexité30. Des travaux récents de Lin et al. comparé quantitativement la qualité de l'image des microtubules immunomarqués à l'aide du colorant Alexa Fluor 647-19. Une autre étude de Diekmann et al. ont montré que deux facteurs critiques (c'est-à-dire la précision de la localisation et l'efficacité de l'étiquetage) déterminent la qualité de l'image SMLM. Ils ont systématiquement étudié les conséquences de la vitesse sur la qualité de l'image pour différents colorants (AF647, CF680, CF660C, Dy634) à différentes efficacités et intensités de marquage21. À notre connaissance, les protéines photocommutables telles que Dendra 2 n’ont jamais été démontrées pour l’imagerie rapide et la microscopie de localisation accélérée et représentent donc une classe importante de sondes utilisées en microscopie à super-résolution. Plus précisément, les protéines photocommutables permettent le clonage/la conjugaison avec une protéine d’intérêt, ce qui les rend adaptées à l’étude des processus biologiques (tels que la progression de la maladie31,32,33) et aident à comprendre le mécanisme sous-jacent.